1 冷凍管應如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入 37 C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。

2 細胞冷凍管解凍培養時，是否應馬上去除 DMSO？

除少數特別注明對 DMSO 敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，應直接放入含有 10-15ml 新鮮培養基之培養角瓶中，待隔天再置換新鮮培養基以去除 DMSO  即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

3 可否使用與原先培養條件不同之培養基？

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基，若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活。

4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類？

不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5 何謂 FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum)  是相同的意思，兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum)  則是指小牛血清。HS (horseserum)  則是指馬血清。

6 培養細胞時應使用 5 %或 10% CO2？或根本沒有影響？

一般培養基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為 pH 的緩沖系統，而培養基中 NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的 CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升 3.7 g 時，細胞培養時應使用 10% CO2；當培養基中NaHCO3 為每公升 1.5 g 時，則應使用 5% CO2 培養細胞。

7 何時須更換培養基？

視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。

8 培養基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態下，培養基中不應添加任何抗生素。

9 附著性細胞繼代時所使用之 trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？

一般使用之 trypsin-EDTA 濃度為 0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20 C，避免反復冷凍解凍造成 trypsin 之活性降低，并可減少污染之機會。

10 懸浮性細胞應如何繼代處理？

一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養液太多時，可將培養角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶，加入新鮮培養基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。

11 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？

欲回收動物細胞，其離心速率一般為 300xg (約 1,000rpm)，5 - 10 分鐘，過高之轉速，將造成細胞死亡。

12 細胞之接種密度為何？

依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

13 細胞冷凍培養基之成份為何？

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含 5 - 10% DMSO (dimethyl

sulfoxide) 和 90 - 95 %原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于

DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。

14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？

冷凍保存使用之 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 之 DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 C，避免反復冷凍解凍造成 DMSO 之裂解而釋出有害物質，并可減少污染之機會。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 之 Nylon 材質濾膜。

15 冷凍保存細胞之方法？

冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 C 30~60 分鐘 → (-20 C 30 分鐘) → -80 C16~18 小時(或隔夜) → 氮槽 vapor phase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降 1-3 C 至–80 C  以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。*-20 C 不可超過 1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80 C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

16 細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？

冷凍管內細胞數目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

17 應如何避免細胞污染？

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染的好方法。

18 如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？ 加入相應抗生素，直接滅菌后丟棄之。

19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？

不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。

20 支原體污染會對細胞培養有何影響？

支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數，代謝及研究任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為 mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。

        21 細胞株有支原體污染時， 該如何處理？ 

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。

22 CO2 培養箱之水盤如何保持清潔？

定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。